جزئیات برگزاری کارگاه وسترن بلاتینگ، مراحل انجام و آنالیز داده‌های آن

برگزاری کارگاه وسترن بلاتینگ،مراحل انجام و آنالیز داده‌های آن با برترین اساتید و به صرفه ترین هزینه.....

همراه با میان وعده و ناهار

16 ساعت

ظرفیت محدود 4 نفر

• تعیین غلظت با اسپکتروفتومتری
• اصول و مبانی SDS-PAGE وسترن بلات
• انتقال به کاغذ نیتروسلولوز
• بلوکه کردن کاغذ نیتروسلولز
• بلاتینگ کاغذ با آنتی بادی اولیه و ثانویه

برای اطلاع از جزئیات هزینه و ثبت نام دو تا راه دارید:

یا تماس بگیرید تلفن موسسه و داخلی مشاورین رو بگیرید: 02166574345 داخلی 6

یا به مشاورین پیام بدید از طریق تلگرام، ایتا و یا واتساپ  جزئیات رو بپرسید.

شماره مشاورین: 09037321941 - 09037321942

 کارگاه وسترن بلاتینگ، مراحل انجام و آنالیز داده‌های آن برای چه گروه‌های تحصیلی و شغلی مفید و کاربردی است؟

بریم یه تعریفی از کارگاه وسترن بلاتینگ، مراحل انجام و آنالیز داده‌های آن داشته باشیم.

مراحل انجام وسترن بلاتینگ

آماده‌سازی نمونه

اولین مرحله در وسترن بلاتینگ، آماده‌سازی نمونه‌های پروتئینی است. این مرحله شامل استخراج پروتئین‌ها از سلول‌ها یا بافت‌ها، تعیین غلظت پروتئین و تهیه نمونه برای الکتروفورز است. در این مرحله، از بافرهای استخراج مناسب و ترکیبات حفاظتی برای حفظ ساختار و فعالیت پروتئین‌ها استفاده می‌شود.

الکتروفورز ژل پلی‌اکریل‌آمید (SDS-PAGE)

مرحله بعدی، جداسازی پروتئین‌ها بر اساس وزن مولکولی آن‌ها از طریق الکتروفورز ژل پلی‌اکریل‌آمید (SDS-PAGE) است. در این روش، پروتئین‌ها ابتدا با سدیم دودسیل سولفات (SDS) دناتوره شده و سپس بر روی ژل پلی‌اکریل‌آمید بارگذاری می‌شوند. جریان الکتریکی باعث حرکت پروتئین‌ها در ژل می‌شود و آن‌ها بر اساس وزن مولکولی‌شان از هم جدا می‌شوند.

انتقال پروتئین‌ها به غشا

پس از جداسازی پروتئین‌ها، آن‌ها به یک غشا نیتروسلولز یا PVDF منتقل می‌شوند. این مرحله که به آن بلاتینگ می‌گویند، شامل قرار دادن ژل و غشا در یک دستگاه انتقال الکتریکی است که پروتئین‌ها را از ژل به غشا منتقل می‌کند. این فرآیند معمولاً با استفاده از الکتروبلاتینگ انجام می‌شود.

بلوکه کردن غشا

برای جلوگیری از اتصال غیراختصاصی آنتی‌بادی‌ها به غشا، لازم است که غشا با یک محلول بلوکه‌کننده مانند شیر خشک یا بافرهای بلوکه‌کننده پوشانده شود. این مرحله بسیار مهم است زیرا به دقت و صحت نتایج نهایی کمک می‌کند.

انکوباسیون با آنتی‌بادی اولیه

در این مرحله، غشا با آنتی‌بادی اولیه که به طور خاص به پروتئین هدف متصل می‌شود، انکوبه می‌شود. این آنتی‌بادی معمولاً از یک گونه حیوانی خاص تولید می‌شود و مستقیماً به پروتئین مورد نظر متصل می‌شود.

انکوباسیون با آنتی‌بادی ثانویه

پس از شستشوی غشا برای حذف آنتی‌بادی‌های اولیه غیر متصل، غشا با آنتی‌بادی ثانویه انکوبه می‌شود. آنتی‌بادی ثانویه معمولاً به یک آنزیم یا مولکول فلورسنت متصل است که به شناسایی و تشخیص پروتئین هدف کمک می‌کند. این آنتی‌بادی به آنتی‌بادی اولیه متصل می‌شود و سیگنال تقویت می‌شود.

شستشو و توسعه سیگنال

در این مرحله، غشا با بافرهای شستشو شسته می‌شود تا هر گونه آنتی‌بادی ثانویه غیر متصل از بین برود. سپس غشا با یک سوبسترا انکوبه می‌شود که باعث تولید سیگنال نوری یا رنگی قابل مشاهده می‌شود. این سیگنال معمولاً توسط فیلم عکاسی یا دستگاه‌های تصویربرداری دیجیتال قابل شناسایی و ثبت است.

آنالیز داده‌های وسترن بلاتینگ

کمی‌سازی پروتئین‌ها

برای کمی‌سازی پروتئین‌ها، می‌توان از نرم‌افزارهای تحلیل تصویر استفاده کرد. این نرم‌افزارها قابلیت اندازه‌گیری شدت باندهای پروتئینی را دارند و می‌توانند غلظت پروتئین‌ها را در نمونه‌های مختلف مقایسه کنند.

کنترل‌های داخلی و خارجی

استفاده از کنترل‌های داخلی و خارجی در وسترن بلاتینگ برای تضمین صحت و دقت نتایج ضروری است. کنترل‌های داخلی معمولاً پروتئین‌هایی هستند که در همه نمونه‌ها با مقدار ثابت وجود دارند و به عنوان مرجع برای نرمال‌سازی داده‌ها استفاده می‌شوند. کنترل‌های خارجی شامل پروتئین‌هایی با غلظت معلوم هستند که به عنوان معیار سنجش عمل می‌کنند.

تکرارپذیری و صحت

یکی از نکات مهم در آنالیز داده‌های وسترن بلاتینگ، تکرارپذیری و صحت نتایج است. برای اطمینان از این موضوع، بهتر است آزمایش‌ها چندین بار تکرار شوند و نتایج با هم مقایسه شوند.

رفع خطاهای احتمالی

در فرآیند وسترن بلاتینگ ممکن است خطاهای مختلفی رخ دهد که می‌تواند بر دقت و صحت نتایج تأثیر بگذارد. برخی از این خطاها شامل اتصال غیراختصاصی آنتی‌بادی‌ها، اشتباه در انتقال پروتئین‌ها، یا مشکلات در تهیه نمونه می‌باشند. برای رفع این خطاها، می‌توان از بهینه‌سازی شرایط آزمایش، استفاده از بافرهای مناسب و انجام کنترل‌های دقیق استفاده کرد.